ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПРОТЕАЗЫ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ ИЗ КЛЕТОК Escherichia coli

Авторы: Рябченко А.В.¹, Котова М.В.², Князев Р.А.³, Трифонова Н.В.⁴, Поляков Л.М.⁵

Реферат

Каталитический домен белка ядерного включения вируса табачной мозаики TEVp используется для расщепления искусственных слитых полипептидов. Однако получение рекомбинантного фермента имеет определенные трудности из-за низкого выхода продукта и его малой растворимости в физиологических растворах. Цель исследования – оптимизация способов получения рекомбинантного фермента TEVp из клеток-продуцентов Escherichia coli. Материал и методы. Исследования выполняли на клетках E. coli штамм BL21(DE3), продуцентах рекомбинантной протеазы. Фермент синтезировался клетками в виде слитого полипептида с мальтозосвязывающим белком (MBP) с последующим саморасщеплением. Наработку биомассы проводили при различных условиях: изменение температурного режима, времени инкубации клеток с индуктором (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид), концентрации индуктора и фазы роста культуры при добавлении индуктора. Фермент выделяли с помощью аффинной хроматографии в нативных условиях и с увеличенной концентрацией хлорида натрия, его активность проверяли на химерном рекомбинантном аполипопротеине А-I человека (~33,4 кДа). Результаты их обсуждение. Значительное влияние на конечный выход фермента оказывала фаза роста культуры при добавлении индуктора. Оптимальными условиями получения биомассы были найдены следующие: температура инкубации с индуктором 30 °С; время инкубации 4 ч; концентрация индуктора 200 мкМ; оптическая плотность при добавлении индуктора 2,0–2,5 о.е./мл (конец экспоненциальной фазы роста культуры клеток). Концентрация хлорида натрия в буферном растворе при выделении белка составила 150 мМ. Выход фермента в данных условиях достигал 50 мг/л культуры клеток. Во всех случаях полученный фермент сохранял свою активность. Заключение. На выход рекомбинантного фермента из клеток-продуцентов E. coli шт. BL21(DE3) в экспрессирующем векторе pD441-MBP под регуляцией гена бактериофагового промотора «Т5» наибольшее влияние оказывает фаза роста культуры клеток в момент запуска экспрессии гена.

Тэги

рекомбинантный белок, протеаза вируса табачной мозаики, Escherichia coli

Список литературы

1. Рябченко А.В., Котова М.В., Поляков Л.М. Получение продуцента протеазы вируса табачной мозаики // Междунар. журн. прикл. и фундам. исслед. 2015. (12-5). 859–862.

2. Рябченко А.В., Котова М.В., Твердохлеб Н.В., Князев Р.А., Поляков Л.М. Получение рекомбинантного аполипопротеина А-I человека и исследование его биологических свойств // Клеточ. технологии в биологии и медицине. 2015. (3). 155–159

3. Blommel P.G., Fox B.G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease // Protein Expr. Purif. 2007. 55. (1). 53–68.

4. Cabrita L.D., Gilis D., Robertson A.L., Dehouck Y., Rooman M., Bottomley S.P. Enhancing the stability and solubility of TEV protease using in silico design // Protein Sci. 2007. 16. (11). 2360–2367.

5. Fang L., Jia K.Z., Tang Y.L., Ma D.Y., Yu M., Hua Z.C. An improved strategy for high-level production of TEV protease in Escherichia coli and its purification and characterization // Protein Expr. Purif. 2007. 51. (1). 102–109.

6. Kapust R.B., Tozser J., Fox J.D., Anderson D.E., Cherry S., Copeland T.D., Waugh D.S. Tobacco etch virus protease: Mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency // Protein Eng. 2001. 14. (12). 993–1000.

7. Kapust R.B., Waugh D.S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused // Protein Sci. 1999. 8. (8). 1668–1674.

8. Lucast L.J., Batey R.T., Doudna J.A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease // Biotechniques. 2001. 30. (3). 544–546.

9. Nautiyal K., Kuroda Y. A SEP tag enhances the expression, solubility and yield of recombinant TEV protease without altering its activity // N. Biotechnol. 2018. 42. 77–84.

10. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures // Protein Expr. Purif. 2005. 41. (1). 207–234.

11. Sun C., Liang J., Shi R., Gao X., Zhang R., Hong F., Yuan Q., Wang S. Tobacco etch virus protease retains its activity in various buffers and in the presence of diverse additives // Protein Expr. Purif. 2012. 82. (1). 226–231.

12. Van den Berg S., Lofdahl P., Hard T., Berglund H. Improved solubility of TEV protease by directed evolution // J. Biotechnol. 2006. 121. (3). 291–298.

13. Zou Z., Cao L., Zhou P., Su Y., Sun Y., Li W. Hyper-acidic protein fusion partners improve solubility and assist correct folding of recombinant proteins expressed in Escherichia coli // J. Biotechnol. 2008. 135. (4). 333–339.

Об авторах (для корреспонденции):

Поляков Л.М. – д.м.н., проф., зав. лабораторией медицинской биотехнологии, e-mail plm@niibch.ru

Полный текст

snmzh_6-2018_ryabchenko_13-18.pdf

Поступило: 18/12/2018

Принято к печати: 18/12/2018